Berhem
Kîta tespîtkirina SARS-Cov-2-RT-PCR ya Lifecosm ji bo 2019-nCoV
Bikaranîna çaverêkirî
Ev kît ji bo tespîtkirina kalîtîf a koronavîrusa nû (2019-nCoV) bi karanîna paçên qirikê, paçên nazofarîngeal, şilava şuştina bronkoalveolar, û tayê tê bikar anîn. Encama tespîtkirina vê hilberê tenê ji bo referansa klînîkî ye, û divê wekî yekane delîl ji bo teşhîs û dermankirina klînîkî neyê bikar anîn. Analîzek berfireh a rewşê bi hev re bi xuyangên klînîkî yên nexweş û testên din ên laboratîfê re tê pêşniyar kirin.
Prensîba Teftîşê
Kît li ser teknolojiya RT-PCR ya yek-gavî ye. Bi rastî, genên ORF1ab û N yên koronavîrusa nû ya 2019an (2019-nCoV) wekî herêmên hedef ên amplîfîkasyonê hatin hilbijartin. Prîmerên taybetî û sondajên floresan (sondên gena N bi FAM û sondajên ORF1ab bi HEX hatine nîşankirin) ji bo tespîtkirina RNAya koronavîrusa cureya nû ya 2019an di nimûneyan de hatine çêkirin. Kît di heman demê de pergalek tespîtkirina kontrola navxweyî ya endojîn (sonda gena kontrola navxweyî bi CY5 hatiye nîşankirin) jî vedihewîne da ku pêvajoya berhevkirina nimûneyan, RNA û amplîfîkasyona PCR bişopîne, bi vî rengî encamên neyînî yên derewîn kêm bike.
Pêkhateyên sereke
| Pêkhateyên | Bend（48T/Kît） |
| Çareseriya reaksiyonê ya RT-PCR | 96µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864µl |
| Kontrola neyînî | 1500µl |
| nCOV Kontrola erênî (l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
Reagentên xwemalî: Reagentên derxistina RNA an paqijkirinê. Kontrola neyînî/pozîtîf: Kontrola erênî RNA ye ku perçeya hedef dihewîne, lê kontrola neyînî ava bê asîda nukleîk e. Di dema karanînê de, divê ew beşdarî derxistinê bibin û divê wekî enfeksiyonê werin hesibandin. Divê li gorî rêziknameyên têkildar werin destgirtin û avêtin.
Gena referansa navxweyî gena RnaseP ya mirovî ye.
Mercên hilanînê û dîroka qedandinê
-20±5℃, ji cemidandin û helandina dubarekirî ya ji 5 caran zêdetir dûr bisekinin, ji bo 6 mehan derbasdar e.
Amûra sepandinê
Bi FAM / HEX / CY5 û amûrên din ên PCR-ya floresan a pir-kanal.
Pêdiviyên nimûneyê
1. Cureyên nimûneyên sepandinî: paçên qirikê, paçên nazofarîngeal, şilava şuştina bronkoalveolar, tayê.
2. Berhevkirina nimûneyê (teknîka aseptîk)
Paçê farînksê: Di heman demê de tonsîkan û dîwarê farînksê yê paşîn bi du paçêyan paqij bikin, dûv re serê paçê bixin nav lûleyek ceribandinê ya ku çareseriya nimûneyê tê de ye.
Tûf: Piştî ku nexweş kuxikeke kûr, tûfa kuxkirî di lûleyeke ceribandinê ya bi qapaxa pêçayî de ku çareseriya nimûneyê tê de ye berhev bikin; şilava şuştina bronkoalveolar: Nimûnegirtin ji hêla pisporên bijîşkî ve. 3. Hilanîn û veguhastina nimûneyan
Divê nimûneyên ji bo veqetandina vîrusê û testa RNA-yê di zûtirîn dem de werin ceribandin. Nimûneyên ku di nav 24 demjimêran de werin tespîtkirin dikarin di 4℃ de werin hilanîn; yên ku di nav 24 demjimêran de neyên tespîtkirin.
demjimêran divê di -70℃ an jî li jêr de werin hilanîn (eger şertek hilanînê ya -70℃ tune be, divê ew werin
demkî di sarincokê de -20℃ tê hilanîn). Divê nimûne di dema veguhastinê de ji cemidandin û helandina dubare ya nimûneyan dûr bisekinin. Divê nimûne piştî berhevkirinê di zûtirîn dem de ji laboratûarê re werin şandin. Ger hewce be ku nimûne ji dûrên dirêj ve werin veguhastin, hilanîna qeşaya hişk tê pêşniyar kirin.
Rêbazên Testê
1 Pêvajoya nimûneyê û derxistina RNAyê (qada pêvajoya nimûneyê)
Ji bo derxistina RNAyê tê pêşniyarkirin ku 200 μl nimûneya şile were girtin. Ji bo gavên derxistinê yên têkildar, li rêwerzên kîtên derxistina RNAyê yên bazirganî binêrin. Hem neyînî û hem jî neyînî
Kontrolên di vê kîtê de di derxistinê de beşdar bûn.
2 Amadekirina reagenta PCR (qada amadekirina reagentê)
٢.١ Hemû pêkhateyan ji kîtê derxînin û di germahiya odeyê de bihelînin û tevlihev bikin. Berî karanînê çend saniyeyan bi 8,000 rpm santrifuj bikin; mîqdara pêwîst a reagentan hesab bikin, û pergala reaksiyonê wekî ku di tabloya jêrîn de tê nîşandan tê amadekirin:
| Pêkhateyên | Servîsa N (sîstema 25µl) |
| nCOV primer TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| Çareseriya reaksiyonê ya RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = hejmara nimûneyên ceribandî + 1 (kontrola neyînî) + 1 (nCOV)kontrola erênî) | |
٢.٢ Piştî tevlihevkirina tevahî ya pêkhateyan, ji bo demek kurt santrifuj bikin da ku hemû şileya li ser dîwarê lûleyê bikeve binê lûleyê, û dûv re pergala zêdekirina ٢٠ µl di nav lûleya PCR de belav bikin.
3 Nimûnegirtin (qada amadekirina nimûneyê)
Piştî derxistinê 5μl ji kontrolên neyînî û erênî lê zêde bikin. RNAya nimûneya ku were ceribandin li lûleya reaksiyona PCR-ê tê zêdekirin.
Qapaxa lûleyê bi hişkî bigirin û berî ku hûn wê veguhezînin qada tespîtkirina zêdekirinê, çend santrifuj bikin bi leza 8,000 rpm.
4 Zêdekirina PCR (qada tespîtkirinê ya zêdekirî)
4.1 Lûleya reaksiyonê têxin nav xaneya nimûneyê ya amûrê û parametreyan wiha saz bikin:
| şanocî | Zîvirok jimare | Germî(°C) | Dem | berhevkirîmalper |
| Gara paşîtranskrîpsiyon | 1 | 42 | 10 deqe | - |
| Pêş-denaturasyonn | 1 | 95 | 1 deqe | - |
| Zîvirok | 45 | 95 | 15 çirke | - |
| 60 | 30an | berhevkirina daneyan |
Hilbijartina kanala tespîtkirina amûrê: Ji bo sînyala fluoresansê kanala FAM, HEX, CY5 hilbijêrin. Ji bo sînyala fluoresansa referansê NONE, ji kerema xwe ROX hilbijêrin.
5 Analîza encaman (Ji bo mîhengkirinê ji kerema xwe li rêwerzên ceribandinê yên her amûrê binêrin)
Piştî reaksiyonê, encaman tomar bikin. Piştî analîzê, nirxa destpêkê, nirxa dawî, û nirxa eşikê ya xeta bingehîn li gorî wêneyê rast bikin (bikarhêner dikare li gorî rewşa rastîn rast bike, nirxa destpêkê dikare li ser 3~15 were danîn, nirxa dawî dikare li ser 5~20 were danîn, rastkirin) di grafîka logarîtmîk de. Li eşikê pencereyê, xeta eşikê di qonaxa logarîtmîk de ye, û xêza zêdekirinê ya kontrola neyînî xêzek rasterast an jî di binê xeta eşikê de ye).
6 Kontrola Kalîteyê (Kontroleke prosedurî di testê de heye) Kontrola neyînî: Ji bo kanalên tespîtkirina FAM, HEX, CY5 xêzeke amplîfîkasyonê ya eşkere tune ye
Kontrola erênî ya COV: xêza amplîfîkasyonê ya eşkere ya kanalên tespîtkirina FAM û HEX, nirxa Ct ≤32, lê xêza amplîfîkasyonê ya kanala CY5 tune ye;
Divê şertên jorîn di heman ezmûnê de di heman demê de werin bicîhanîn; wekî din, ezmûn nederbasdar e û pêdivî ye ku were dubarekirin.
7 Diyarkirina encaman.
7.1 Heke di kanalên FAM û HEX ên nimûneya testê de xêza amplîfîkasyonê an nirxa Ct> 40 tune be, û di kanala CY5 de xêzek amplîfîkasyonê hebe, dikare were texmîn kirin ku di nimûneyê de RNA-ya koronavirusê nû ya 2019 (2019-nCoV) tune ye;
.2 Heke nimûneya testê di kanalên FAM û HEX de xêzên amplîfîkasyonê yên eşkere hebin, û nirxa Ct ≤40 be, dikare were texmîn kirin ku nimûne ji bo koronavîrusa nû ya 2019 (2019-nCoV) pozîtîf e.
7.3 Heke nimûneya ceribandinê tenê di yek kanala FAM an HEX de xêzeke amplîfîkasyonê ya zelal hebe, û nirxa Ct ≤40 be, û di kanala din de xêzeke amplîfîkasyonê tune be, encam hewce ne ku ji nû ve werin ceribandin. Heke encamên ceribandina ji nû ve lihevhatî bin, nimûne dikare ji bo testa nû wekî pozîtîf were hesibandin.
koronavîrusa 2019 (2019-nCoV). Ger encama ceribandina ji nû ve neyînî be, dikare were texmînkirin ku nimûne ji bo koronavîrusa nû ya 2019 (2019-nCoV) neyînî ye.
Nirxa nirxandina erênî
Rêbaza xêza ROC ji bo destnîşankirina nirxa referansê ya CT ya kîtê tê bikar anîn û nirxa referansê ya kontrola navxweyî 40 e.
Şîrovekirina encamên testê
1. Divê her ceribandinek ji bo kontrolên neyînî û erênî were ceribandin. Encamên ceribandinê tenê dikarin werin destnîşankirin dema ku kontrol şertên kontrola kalîteyê bicîh bînin.
٢. Dema ku kanalên tespîtkirinê yên FAM û HEX erênî bin, dibe ku encama kanala CY5 (kanala kontrola navxweyî) ji ber pêşbaziya pergalê neyînî be.
3. Dema ku encama kontrola navxweyî neyînî be, ger kanalên tespîtkirina FAM û HEX ên lûleya ceribandinê jî neyînî bin, ev tê vê wateyê ku pergal neçalak e an jî xebat xelet e, test nederbasdar e. Ji ber vê yekê, pêdivî ye ku nimûne ji nû ve werin ceribandin.
